Secuenciación Sanger: Conceptos Básicos
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- Опубліковано 15 вер 2024
- Descripción de la Secuenciación por el Método de Sanger. Principio general y versión automatizada por electroforesis capilar.
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Hay un error en el minuto 3:35, no es ddATP (hay 2) si no que es ddGTP! Muy buen video!
Parece que si se me pasó. ¡Muchas gracias por la corrección!
Pensaba que iba a entender algo, ahora salí con más dudas, creo que mejor me dedico a vender salchipapas
Jamás me imaginé que iba a encontrar un video corto tan claramente explicado. Me sirvió muchísimo.
Tengo examen de genética molecular mañana y este vídeo me ha ayudado bastante :")
Excelente explicación, la verdad no es un tema fácil de entender, pero lo desarrollaste muy bien. Saludos y muchas gracias!
Kajaja la musica y tu voz me hace imaginarte en un sillon con una pipa, un libro y una fogata a lado mientras explica
Nunca lo había visto así, pero ya no puedo quitarme la imagen de mi cabeza. Hahaha.
mejor explicado, que mi profesor durante todo el año. Enhorabuena
PD: no me he mirado el video
muchas gracias entendi como un 25% ahora tengo que encontrar la manera de exponer este tema frente a estudiantes de 1er año de medicina xd
¿Cómo puedo ayudarte con eso!
Vi muchos videos y esto es el que mas me ayudo!
Excelente forma de exponer el tema, realmente está muy claro, Gracias!
Muchas gracias, ya entendí el tema. Muy buena explicación 😊
Fino amigo, no habia entendido este metodo con la precision que me gusta, tu video me salvó la exposicion de mañana.
Tu voz me hace dudar mi heterosexualidad
Sinceramente, cuando empecé a verlo pensé que sería una tarea más de secundaria, pero al final admito que sí fue un muy buen video! muchas gracias amigo
No estabas muy herrado en que era una "tarea de escuela" jaja
Hola buenos dias, soy profesor de biologia molecular y he detectado una pequeña errata en su video, Sanger al ser un nombre ingles, no deberia llevar accento y cercanamente al minuto 3 del video hay una errata puesto q no pone que hayan ddGTPs. Un muy buen video y de gran uso para las enseñanzas del aula. Gracias 🫂
¡Muchas gracias por tus palabras! Fue uno de mis primeros videos, y naturalmente cometí varios errores por ahí, pero me alegra saber que sigue ayudando a la gente.
POR FIN LO ENTIENDO
pd alta voz
Súper bien explicado, muchas gracias!
Gracias, llevo rato intentando comprender y con esto ya lo logré
gracias por el video, bien explicado, de forma sencilla y práctica.
Muchas gracias maestro!! Muy buena explicación!!
Explicas súper bien, Mil gracias!
Muy bien explicado! Muchas gracias
EXCELENTE VIDEO.....MUCHAS GRCIAS...FULL DIDACTICO
muy ilustrativo, gracias.
Cuando hagan la comparación con la secuencia del gel, háganla con la secuencia que aparece en el minuto 1:27. Aunque dije que usaríamos la secuencia complementaria en el minuto 0:34, ahí solo puse una secuencia más pequeña para ilustrar.
te hago una pregunta. Si bien sabemos que separamos las 2 hebras con T, como haces para asegurarte que te quedaste con la secuenca complementaria? y asi bueno, cuando agregas los ddNTP sabes que te dara la secuencua de la codificante? espero se entienda la pregunta
Si diseñas o consigues un primer que solamente sea específico a la complementaria, solo amplificarás esa cadena y solo formarás bandas para esta. La otra cadena no debe causar mucho ruido. Aunque claro, hay formas en las que puedes hacer una purificación de ssDNA. Como los dNTPs y los ddNTPs se utilizan para formar la hebra opuesta a la complementaria (3´- 5´), naturalmente estarás obteniendo la secuencia de la codificante cuando juntes las bandas (5´- 3´).
También, como dato curioso, ese no fue un problema para Frederilck Sanger, considerando que él secuencio el genoma de un virus ssDNA.
@@BrandonOrtizCasas muchas gracias, sobre todo por tomarte el tiempo en responder!!!
¡Es un placer!
muy lindo el video
Excelente...
Bien, gracias!
Excelente video 😃
Gran vídeo 🙌
Gracias!!!!! Me super sirvió!
El tamaño de las cadenas está relacionado con la cantidad de sustrato disponible
Hay que tener en cuenta de que hay mayor concentración de dNTPs, y una menor de ddNTPs. Eso implica de que a medida que se vaya agotando el sustrato será más difícil de que los ddNTPs se asocien a la cadena que se está replicando.
Y si no se unen se irán haciendo más largos, de esto obtenemos que al comienzo de la replicación los fragmentos serán más cortos, y al final más largos
Cómo ya tenemos que segmentos fueron los primeros en ser replicados, eso se extrapolaria al tiempo cronológico en los que fueron agregados
Esto se basa únicamente en probabilidad, por lo que debe hacerse con un número determinado de ddNTPs para que sea efectivo
Esto va tendiendo al orden porque ordena a cada base según lo probable que se situe segun su largo.
Luego se organiza usando las probabilidades para poder brindar una secuencia que seguro se encontrará.
Sin embargo esta secuencia será aquella de la cadena que se replica, más la cadena que se usa de molde no se conoce, para ello, a partir de la secuencia que obtuvimos por este método se hace complementariedad
Hola!! algún ejemplo que pueda dar para explicar de mejor manera esta secuenciación???
Porque se usa la cadena complementaria y no la conductora?
Brandon, podrias hacer unos videos de estrategias de secuenciacion de shotgun y shotgun jerárquico, porfa!!
¡Hola! Claro que si. Solo termino lo que tenía prometido y con gusto.
@@BrandonOrtizCasas Gracias de antemano!
no entendí un pijo xd
Pues la explicación es muy buena, encima te lo muestra gráficamente dudo que encuentres uno mejor, es cierto que el método de fluorocromo se entiende menos, pero aún así se entiende.
Sin embargo, claramente puedes seguir investigando por tu cuenta para encontrar mejores fuentes o fuentes que puedas entender tú.
Excelente!!! Gracias!
Excelente video :) Gracias
Muy bueno
buen video, gracias, pero un poquito mas de enfoque en la parte de lectura de gel de nitrocelulosa, para principiantes como yo. por lo demás bien
¡Muchas gracias! Lo tomaré en cuanta, aunque realmente leer un gel no es nada del otro mundo, y ya no se hace casi en lo absoluto en el mundo (se usa muchísimo más la tecnología capilar).
O hacen la elongación con iguales fragmentos?
En la electroforesis capilar en gel, lo que se marca en las ondas podría decirse que es la secuenciación del ADN codificante? por lo cual posteriormente se tendría que obtener por complementariedad la de la cadena molde?
Correcto. Y la secuencia de la complementaria se obtiene literalmente de inmediato por la complementariedad. Si en un espacio tienes una C en la codifiante, sabes que en ese mismo lugar hay una G en la complementaria.
Hola para cada segmento hay un primer?
Cuando tienes la secuencia de un gen, normalmente los extremos son un poco complicados de interpretar.
Esto es muy cierto. Especialmente con Sanger.
1) ¿Como se que primer usar si desconozco la secuencia del adn molde?
2) ¿Como se conoce el orden de la secuencia por la electroforesis? Si la electroforesis me separa los fragmentos por su peso molecular, como se deduce el orden de la secuencia?
3)¿Por que se marca algo con fluorescencia? ¿De que sirve? ¿Como conozco la secuencia de esa forma?
1.- La primera es una pregunta interesante, además de ser relativamente avanzada. Por lo general, la mayor parte de los organismos modelo ya tienen sus genomas secuenciados, (o al menos, parcialmente secuenciados), por lo que buscar una región con la cual se pueda delimitar y diseñar un primer es relativamente fácil. Sin embargo, suponiendo que nos enfrentaramos a una especie que no encontraramos en una base de datos, lo mejor es empezar buscando información de la especie más cercana a esta, de la que SI tengamos información publicada. Sobre esta, uno puede diseñar un juego de primers degenerados (primers con variantes en la secuencia nucleotídica) y ver cuales funcionan mejor para el propósito.
2.- Pudieras conocer el orden de la secuencia, por que sabes la cantidad de nucleotidos que componen los fragmentos a partir desde el punto de unión al primer (considera este como tu "punto zero"). Las reacciones para cada tipo de base nitrogenada son por separado. y sabes que en cada reacción generarás fragmentos de diversos tamaños. En la antiguedad, se hacían geles enormes de poliacrilamida que eran capaces de hacer una separación de hasta un solo nucleotido. Entonces, inventando una situación; si tuvieras en donde metiste ddntps de A fragmentos con tamaños de 5, 6, y 9 nucleotidos; sabes que en esas posiciones tienens una A. Y así te la vas complementando con los otros nucleotidos, juntando los pedazos y así conociendo tu secuencia.
3.- Hacer geles resultaba sumamente difícil y poco práctico. Para poder automatizar la metodología, se decidió marcar los ddntps con fluoroforos específicos para cada uno. En una electroforesis capilar, los fragmentos se separarán por tamaño, y tu puedes detectar esos fragmentos con base en el fluoroforo que tienen. Mientras más pequeño, más rápido llegarán al detector. Y dependiendo del tipo de luz que genere el fluoróforo, sabrás a que base nitrogenada perteneció. Así como se mostró en la animación del electroferograma.
Muchisimas gracias!!!
tengo una duda... si la DNApol toma los dideoxinucleótidos del medio de forma aleatoria y los integra dependiendo de la posición en la que se encuentre la DNApol, ¿cómo se asegura en el proceso que no se repita un mismo fragmento?
Es decir, si tuviera la secuencia: ATCGGCAAAC como hebra base, no puede ocurrir que el ddNTP añadido se dé en la misma posición que se hizo en otra de las reacciones? P.ej: que al leer la primera adenina, se añada una timina complementaria, pero cuando se lea la Timina, se añada el ddNTP, se genere una hebra con 2 pares de bases y luego, cuando se vuelva a hacer la reacción, la DNApol añada de nuevo el mismo ddNTP anterior, dejando 2 fragmentos repetidos... no sé si me hice entender... o estoy entendiendo mal el proceso
Hola Camilo. Si entendí bien lo que querías decir, puedo decirte que efectivamente, se crean fragmentos repetidos. Pero no solo 2, sino varios miles de fragmentos para cada largo. Y es más, es muy importante que eso pase para que la secuenciación Sanger funcione.
Recuerda que al momento de hacer tu amplificación, estas metiendo una muestra con varias hebras base, con miles de unidades de DNApolimerasas, y con miles y miles de nucleotidos. Durante esta amplificación, se crean miles y miles de fragmentos, de los cuales obviamente, habrá centenares de repetidos de diferentes tamaños. Esto más que ser un inconveniente, es algo muy importante. Puedes ver mi video de PCR, si te cuesta un poco imaginar como se crean estos repetidos.
Por ejemplo, en la seq Sanger hecha en gel, agregamos bromuro de etidio para poder ver los fragmentos en el mismo. Si no hay una concentración lo suficientemente alta de fragmentos en una posición determinada (osea, una suficiente cantidad de ADN para que se intercale la suficiente cantidad de moléculas de EtBr), simplemente no habrá fluoresencia suficiente y no se verá la banda. Si no hay suficiente cantidad de fragmentos con ddntps fluorescentes en una posición determinada, el detector no será capaz de discernir la señal fluorescente en la versión capilarizada.
@@BrandonOrtizCasas si, esa era mi duda.. mil y mil gracias por responder (y hacerlo tan rápida y diligentemente).. una última pregunta.. ¿al quedar miles de fragmentos repetidos, eso no me afectaría al momento de generar mi secuencia? porque al tener tantos, la secuencia generada sería miles de veces más grande que la muestra original, o ¿simplemente, cuando se encuentren esos repetidos, se toman como una unidad?
@@2008hellhammere2008 Todos esos repetidos se toman como una unidad. En la electroforesis, sea en un gel grande o en un capilar, los fragmentos se separan únicamente por tamaño; no por la cantidad de estos. Entonces, todos los miles de fragmentos de una misma longitud, migrarán de la misma forma. Como si estos fueran moviéndose tomados de la mano.
eso es la disminucion en la longitud del segmento analizado?
Hola Ulysses. No entiendo la pregunta. ¿Pudieras hacerla más explícita o profunda, por favor?
Si pudieras explicar su usu me salvaría! 😣😭
Supongo que te refieres a su "uso". La secuenciación como tal tiene literal, decenas y decenas de aplicaciones. ¿Quieres saber un uso en un área particular o usos generales?
@@BrandonOrtizCasas ay Muchas gracias! Quisiera saber bien cuáles serían sus usos en lo que se busca, es decir qué clase de mutaciones se pueden encontrar cuando la usamos?
@@0ryxxx Usos como dije, hay varios. Uno de ellos efectivamente es la identificación de mutaciones.
Técnicamente, la secuenciación Sanger te puede ayudar a identificar casi cualquier mutación puntual o pequeña (SNPs, repetidos, etc), siempre y cuando esté dentro de las limitaciones de la misma técnica (es difícil leer cosas mayores a 700 nucleotidos, y también sería difícil encontrar mutaciones en las primeras 30-40 bases de lectura). Por ejemplo, tendrías más problemas con esta técnica si quisieras detectar aberraciones cromosómicas o CNVs. Si tienes una secuencia pequeña y buscas una mutación en ella, puedes detectarla sin mayor problema (aunque no con la misma fidelidad que una técnica de NGS).
Puedes tambien hacer análisis de metilación de DNA (que para la epigenética viene bastante bien), si lo transformas con bisulfito. Y esos son solo un par de ejemplos. Puedes hacer mucho más.
¿Eso responde tu pregunta?
@@BrandonOrtizCasas si, creo que si! Gracias, de todas maneras es para un exámen que tengo pronto, desde ya muchas gracias x tu tiempo ☺️😊
@@0ryxxx ¡Éxito!
thank you man!
my pleasure!
❤
Qué sería de mí en la universidad si no existiera youtube con este tipo de videos
:)
Como se llaman los fluorocromos? ayudaaa :(
No lo entiendo, si sólo se lee el ddNTP terminal de cada amplicón, qué pasa con todas las bases que hay desde el cebador hasta el ddNTP? esas no se secuencia? entonces no se está secuenciando la cadena de ADN entera no? sólo los nucleótidos que cortan los ddNTP de manera aleatoria. Ayuda :(
Hola María. Como podrás ver, hay varios ddNTPs terminales en diferentes posiciones. Por lo que podrás visualizar un ddNTP terminal en cada uno de los nucleótidos de la secuencia original. Uno tiene que jugar un poquito a "armar el rompecabezas" como hice exactamente en el minuto 3:23
En realidad lo que hace el ddNTP es terminar la cadena, pero las bases entre el cebador y el ddNTP siguen ahí.
Por eso después por electroforesis podemos separar las cadenas en función de su tamaño.
Pongo un ejemplo, con los ddATP tendríamos A, luego ATA, luego ATACGA, luego ATACGTTCA....
Por otra parte, con los ddTTP tendríamos AT, ATACGAT, ATACGATT .... Así con todos los ddNTPs.
Por eso es importante separar los ddNTPs en muestras distintas, para el resultado en la imagen 3:23.
Si lees de abajo a arriba (de menor a mayor tamaño), puedes determinar el orden exacto de la cadena.
No sólo se lee el ddNTP, se lee la cadena entera hasta llegar a ese punto.
El resto, al no estar sintetizado, no pasa nada.
Me quedo una duda y espero me la puedas responder por favor jeje
Como es posible que los ddNTPs se detengan en 4 posibles lugares si se supone que si se detiene en uno la Polimerasa se detiene?
Como tal, no es que tengan 4 posibles lugares por cada nucleotido. En la secuenciación clásica de Sanger, la polimerasa se detendrá tan pronto tenga contacto con un ddNTP. Sin embargo, hay que considerar que en una reacción para cada base, también se tienen dNTPs de esa base. En una reacción donde quieres estudiar adeninas y usas únicamente ddNTPs de adeninas, usarás también dNTPs de adeninas (los cuales por lo general, competirán por las timinas complementarias y estarán en concentraciones mayores). Puede que ninguno de los ddNTPs tenga contacto con una hebra, por lo que se formará una copia completa. O puede que encuentre su base complementaria y detenga a la polimerasa, lo cual podría formar copías de diferentes tamaños. En un tubo, existen todas las posiblidades, y estas las analizamos de acuerdo a su peso molecular.
@@BrandonOrtizCasas Tengo la misma duda y considero que tu respuesta no está aclarando la duda, te pregunto en cada tubo de ensayo hay varias copias de ADN de tal forma que la polimerasa secuencia una cadena hasta que se corta por el didesoxi e inicia con otra nueva cadena, o solo se agrega una hebra de ADN donde se realiza todo proceso deja esta claridad por favor. Muchas gracias.
@@elsieelaarroyolandazuri9707 creo que ya capté la duda. Espero poder responderla adecuadamente. La respuesta corta, es que tienes cientos de hebras de DNA en cada tubo. Por lo que en cada tubo, tendrás varias moléculas que se "cortaron" en diferentes partes. Las bandas que vez en el gel, son varios cientos de hebras que fueron bloqueadas en esas posiciones.
Cuando uno extrae DNA de lo que sea, obtiene varias centenas (o de plano) miles de moléculas de DNA. Cuando extraemos DNA humano, básicamente obtenemos el DNA de una muestra de sangre, carrillo bucal, saliva, etc; donde muchísimas células son lisadas y nos brindan su material genético. Cuando extraemos DNA de bacterias, básicamente obtenemos DNA de muchísimas de ellas. Cuando obtenemos nuestra muestra para secuenciar, y la dividimos en 4, esperamos tener material genético suficiente para cada reacción.
Es más... Antes de secuenciar, debemos corroborar que el DNA tiene una pureza considerable, y una CONCENTRACIÓN suficiente del mismo. Eso generalmente lo checamos con espectofotometría. Está un poco difícil meter una única molécula de DNA (no había una tecnología que permitiera eso cuando fue inventada la técnica) y no sería nada práctico para secuenciación Sanger. Aún así, SI SE PUEDE REALIZAR SECUENCIACIÓN DE UNA SOLA MOLÉCULA. Ya cuando tenga tiempo, estaré subiendo algún video de esas novedosas tecnologías. Espero que respondiera la duda.
Vale, pero como cojones diseño un primer específico si no conozco la secuencia. No habría que hacer random priming?
Puedo contestar esto, pero será un viaje...
Sanger no es históricamente la primera forma de determinar la secuencia de DNA y ya se conocían para entonces (más o menos) ciertas secuencias de oligonucleotidos concenso. Por ejemplo, 2 años antes, F. Sanger ya ejecutaba el método "Plus and Minus", para lo cual ya tenía un primer consenso de un fago ΦX que era AGAAATAAAA (algo que ya conocíamos desde 1973, 4 años antes del método Sanger).
Y para determinar estas secuencias, tendríamos que irnos a una década atrás de varios experimentos anteriores que justamente nos dieron las bases de todo lo que menciono en este video. Por ejemplo, rescato el trabajo de científicos como como Ray Wu y Kaiser que determinaron la secuencia de los "Sticky ends" de un fago lambda, los cuales intentaron "llenar" utilizando nucleotidos trifosfato individuales, una polimerasa y mucha fe.
La historia de la secuenciación pre-Maxam/Gilbert-Sanger es bastante fascinante (cuando los biólogos moleculares eran más químicos y realmente se quebraban la cabeza resolviendo problemas), pero lamentablemente se conoce muy poco y se divulga mucho menos.
Hola
Segun yo, no coincide la secuencia secuenciada con la molde o codificante si yo leo desde el abajo a arriba en la electroforesis
Si coinciden. Nuestra secuencia original es la molde (3´- 5´): GGTATCGTTCAA, Lo que obtenemos si leemos de abajo a arriba en el gel es la codificante o 5´- 3: CCATAGCAAGTT.
Toma la secuencia del minuto 1:27. Creo que causé una confusión por ahí cuando dije que usaran la complementaria... Pondré un comentario al respecto. ¡Pero gracias!
@@BrandonOrtizCasas la codificante y la complementaria tienen 3 bases menos que las que dijiste
@@BrandonOrtizCasas ah disculpa, estaba viendo la que aparecia al principio que es diferente a la del minuto 1:51
@@Niqhooz No te preocupes. Fue una ambigüedad causada por mi, pero ya puse una nota al respecto.
¿Para que se usa ?
La secuenciación, en todas sus formas, sirve para determinar la secuencia exacta de DNA de cualquier organismo.
Para clonar el ADN que vector se usa?
Creo que definir un vector de clonación dependería de demasiadas cosas. En primera instancia, del tamaño de los fragmentos que usarás (considerando que el límite superior de Sanger para una buena lectura, es un poco pequeño), y de la cantidad de información que uno quiere secuenciar. No es lo mismo usar Sanger para detectar una serie de repetidos, que usar la técnica para tratar de secuenciar todo un genoma. Por dar un ejemplo, en el Proyecto del Genoma Humano de Francis Collins, apostaron a la clonación por BACs debido a su gran estabilidad. Algunos investigadores simplemente preferirían usar PCR para realizar la clonación, en vez de usar algún vector.
Brandon Ortiz Casas Gracias por tomarte el tiempo de responder
¡Es un placer!
Quita la música !!!!!!!
no puedo :(