35:40 이 부분 잠깐 댓글로 의견 남기고 갑니다. 좌측 사진의 첫번째 gating과 두번째 gating의 차이는 아래 figure 설명에 써있듯 media색이 노랗게 될 정도로 키운 cell을 harvest하여 찍었을 경우에, 우측 gating이 정상적으로 harvest한 첫번째 gating에 비하여 cytokine 발현이 현저히 낮게 나타나는 것을 보여주는 것으로 보입니다. 죽은세포라고 설명해주셨던 Q2부분은 IFN-r와 IL-17A를 모두 발현하는 cell population으로 볼 수 있을 듯 합니다. 죽은 세포의 경우 autofluorescent 비율이 높아서 higly-expressed cell과 구별이 어렵습니다. FACS 실험을 자주 사용했던 입장으로써 실험자분들은 dead cell-staining은 꼭 사용하시길 권하고 싶습니다. 50분쯤에 언급된 실험의 경우에는 제 견해를 말씀드리자면, 본실험 전에 voltage setting 목적으로 조건 잡는 용으로 facs를 한번 찍는걸 권장드립니다. setting이 잡힌 후에 본실험때에는 잡아놓은 setting에 그대로 recording만 하면 되겠지요 1. 돌연변이가 높은비율(4-50%이상)로 발생하는 조건을 찾습니다 2. 정상 세포와 돌연변이 세포를 가능한 많이 같은 facs 튜브에 담습니다. (많을수록 좋습니다. 전체 cell수는 100만개 이하로 권장하며, 만약 수십만개를 recording한다면 초당 속도는 3000이하로 권장합니다) 3. 만일을 위해 정상세포만 들은 튜브를 준비하거나 2번튜브의 여분을 준비해도 좋습니다 4. ssc(과립도)가 유사하고 모양이나 크기만 변한다는 가정하에 fsc를 조금씩 늘리면서 정상세포와 돌연변이가 구분되는 지점을 찾습니다. 같은종류의 세포라도 돌연변이로 구분될 세포라면 voltage 설정으로 겹치지 않는 두 population이 나뉘게 만들 수 있을것으로 생각됩니다. * 이 경우, 사용할 샘플이 whole blood라면 여러 종류의 cell들이 섞여있어서 적혈구끼리 구분은..아마 힘들겁니다.
1:00:00 전체적으로 shift된 경우, positive/negative 구분은 되어 결과는 볼 수 있겠지만, 일자별로 harvest하였다고 언급하신 것으로 보아서는 앞선 실험과 실험조건 setting 자체가 달라졌다고 볼 수 있기에 재실험을 권장합니다. 재실험시에는 compensation은 새로 설정해야 하고요 경과를 볼 경우에는 같은 compensation setting으로 최대한 동일한 조건하에 분석하는 것이 좋습니다. 비교분석을 할 경우에 경과별로 파일들을 전부 모아서 histogram을 merge할텐데, negative peak가 일부는 10^2부분에 있고 일부는 10^3에 있다면 negative부분이 하나로 겹치지 않겠지요 **기기 정기점검, 수리 등의 경우에는 반드시 엔지니어/기기관리자 점검일 이전의 실험의 compensation은 다시 사용할 수 없음을 명심하셨으면 합니다. 관리자 맡을 당시에도 사용자분들에게 매번 공지했던 사항이긴 한데, 엔지니어나 관리자가 점검을 거칠 시에는 CST라는 과정을 거치게 되는데, 이 과정에서 레이저 설정이 전부 재설정되기에 '이전 레이저 상태'에서 잡혀있던 실험설정들은 이후에 찍을 시에 전과 다르게 나올 수 있습니다. 레이저는 수차례 사용하면서 사용하면서도 자연적으로 조금씩 흔들릴 수 있기 때문에 기기작동에 문제가 없더라도 관리자가 정기적으로 CST점검으로 재설정해주게 됩니다. (점검 여부가 알고 싶을 경우 상단 메뉴CST-> report 클릭시 날짜별 내역 열람 가능합니다) 원칙은 매 실험마다 새로 compensation을 설정해주어야 하나, 여태 실험할 때엔 동일샘플/동일실험의 경우 점검이 없는 한 3개월 정도 까지는 같은 compensation setting에 찍어도 무방했습니다.
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35:40 이 부분 잠깐 댓글로 의견 남기고 갑니다.
좌측 사진의 첫번째 gating과 두번째 gating의 차이는 아래 figure 설명에 써있듯 media색이 노랗게 될 정도로 키운 cell을 harvest하여 찍었을 경우에,
우측 gating이 정상적으로 harvest한 첫번째 gating에 비하여 cytokine 발현이 현저히 낮게 나타나는 것을 보여주는 것으로 보입니다.
죽은세포라고 설명해주셨던 Q2부분은 IFN-r와 IL-17A를 모두 발현하는 cell population으로 볼 수 있을 듯 합니다.
죽은 세포의 경우 autofluorescent 비율이 높아서 higly-expressed cell과 구별이 어렵습니다. FACS 실험을 자주 사용했던 입장으로써 실험자분들은 dead cell-staining은 꼭 사용하시길 권하고 싶습니다.
50분쯤에 언급된 실험의 경우에는 제 견해를 말씀드리자면,
본실험 전에 voltage setting 목적으로 조건 잡는 용으로 facs를 한번 찍는걸 권장드립니다. setting이 잡힌 후에 본실험때에는 잡아놓은 setting에 그대로 recording만 하면 되겠지요
1. 돌연변이가 높은비율(4-50%이상)로 발생하는 조건을 찾습니다
2. 정상 세포와 돌연변이 세포를 가능한 많이 같은 facs 튜브에 담습니다. (많을수록 좋습니다. 전체 cell수는 100만개 이하로 권장하며, 만약 수십만개를 recording한다면 초당 속도는 3000이하로 권장합니다)
3. 만일을 위해 정상세포만 들은 튜브를 준비하거나 2번튜브의 여분을 준비해도 좋습니다
4. ssc(과립도)가 유사하고 모양이나 크기만 변한다는 가정하에 fsc를 조금씩 늘리면서 정상세포와 돌연변이가 구분되는 지점을 찾습니다.
같은종류의 세포라도 돌연변이로 구분될 세포라면 voltage 설정으로 겹치지 않는 두 population이 나뉘게 만들 수 있을것으로 생각됩니다.
* 이 경우, 사용할 샘플이 whole blood라면 여러 종류의 cell들이 섞여있어서 적혈구끼리 구분은..아마 힘들겁니다.
우와... 저도 많이 배워갑니다! 👍👍 상세한 설명 감사드려요!
1:00:00 전체적으로 shift된 경우, positive/negative 구분은 되어 결과는 볼 수 있겠지만, 일자별로 harvest하였다고 언급하신 것으로 보아서는
앞선 실험과 실험조건 setting 자체가 달라졌다고 볼 수 있기에 재실험을 권장합니다.
재실험시에는 compensation은 새로 설정해야 하고요
경과를 볼 경우에는 같은 compensation setting으로 최대한 동일한 조건하에 분석하는 것이 좋습니다.
비교분석을 할 경우에 경과별로 파일들을 전부 모아서 histogram을 merge할텐데,
negative peak가 일부는 10^2부분에 있고 일부는 10^3에 있다면 negative부분이 하나로 겹치지 않겠지요
**기기 정기점검, 수리 등의 경우에는 반드시 엔지니어/기기관리자 점검일 이전의 실험의 compensation은 다시 사용할 수 없음을 명심하셨으면 합니다.
관리자 맡을 당시에도 사용자분들에게 매번 공지했던 사항이긴 한데, 엔지니어나 관리자가 점검을 거칠 시에는 CST라는 과정을 거치게 되는데,
이 과정에서 레이저 설정이 전부 재설정되기에 '이전 레이저 상태'에서 잡혀있던 실험설정들은 이후에 찍을 시에 전과 다르게 나올 수 있습니다.
레이저는 수차례 사용하면서 사용하면서도 자연적으로 조금씩 흔들릴 수 있기 때문에 기기작동에 문제가 없더라도 관리자가 정기적으로 CST점검으로 재설정해주게 됩니다.
(점검 여부가 알고 싶을 경우 상단 메뉴CST-> report 클릭시 날짜별 내역 열람 가능합니다)
원칙은 매 실험마다 새로 compensation을 설정해주어야 하나, 여태 실험할 때엔 동일샘플/동일실험의 경우 점검이 없는 한 3개월 정도 까지는 같은 compensation setting에 찍어도 무방했습니다.
@@뇨로로롱 정말 많이 배워갑니다. 너무 멋지세요 👍👍