Hahaha questo video è una salvezza l'ho guardato qualche mese fa per un interrogazioni di quinto anno di liceo ed adesso mi ritrovo a riguardarlo per prepararmi al test di medicina
Ferdinando Melis sei un’icona un genio un salvatore, un uomo che ha capito che certe cose si spiegano prima di tutto con dimostrazioni grafiche e con semplicità e non facendo i sapientoni come fanno certi professori dando per scontato miliardi di cose fondamentali . Se un giorno sarò medico sarà anche grazie a questo tuo video , anche grazie a te . Grazie grazie grazie
Di seguito quello che viene detto nel video.. ho aggiunto le temperature di denaturazione, la T necessaria per far appaiare i primers e la T necessaria per la DNA polimerasi. la punteggiatura non è delle migliori perchè ho fatto tutto di fretta e per di più con il cellulare. Il sequenziamento del DNA permette di conoscere l'esatta sequenza di nucleotidi di una molecola di DNA. Negli anni 70 Fredericks Sanger mise a punto metodo che ha premesso di sequenziare frammenti di DNA o interi genomi. Immaginiamo di dover sequenziare solo una porzione di DNA, prima è necessario amplificarlo cioè averne molte copie, per farlo si ricorre alla PCR reazione a catena della polimerasi, a questo punto le copie amplificate devono essere denaturate i due filamenti vengono separati grazie a un aumento della temperatura a 94° C, si abbassa poi la temperatura a 55° C per fare appaiare i primers, si abbassa ulteriormente a 37° C aggiungendo la DNA polimerasi (un enzima che sintetizza un nuovo filamento di DNA a partire dal filamento stampo) per avviare la sintesi è necessario anche di un primer ovvero un oligonucleotide prodotto ad hoc per legarsi al DNA da sequenziare, e servono le unità che compongono il DNA cioè desossiribonucleotidi trifosfato (dNTPs), che trasportano le quattro basi azotate: adenina, timina, guanina e citosina. Si aggiunge infine una piccola quantità di nucleotidi modificati, la modifica riguarda lo zucchero che compone il nucleotide, rispetto ai desossiribonucleotidi manca il gruppo ossidrile in posizione 3'. La chiave del metodo di sequenziamento è proprio in questa piccola differenza. Il nucleotide modificato ha anche un'altra particolarità, è legato a un marcatore fluorescente indispensabile per poter vedere il risultato. Si usano marcatori fluorescenti di quattro colori diversi uno per ciascun tipo di base azotata. Completata la miscela si avvia la sintesi di un nuovo filamento di dna. La dna polimerasi si lega al primer e aggiunge un nucleotide alla volta sempre rispettando la regola della complementarietà delle basi, il nuovo filamento si allunga finché sono aggiunti nucleotidi normali ma quando ne è inserito uno modificato la sintesi si arresta, la mancanza del gruppo ossidrile le impedisce infatti la formazione di un legame con il nucleotide successivo e provoca il distacco della DNA polimerasi. il risultato di questa fase è la formazione di un frammento di DNA a doppio filamento che ha l’ultimo nucleotide marcato. L'interruzione della sintesi è l'elemento cruciale del metodo di Sanger e che perciò è chiamato metodo terminazione di catena. L'inserimento di un nucleotide modificato è dovuto al caso per cui anche la lunghezza del filamento sintetizzato risulta casuale ma se la sintesi avviene tante volte grazie alle copie prodotte con la PCR avremo filamenti di tutte le lunghezze possibili di poche basi o lunghi quanto l'intera porzione di DNA da sequenziare. Nella fase successiva si denatura nuovamente il DNA i singoli filamenti vengono quindi sottoposti ad elettroforesi capillare con questa tecnica la miscela è inserita in un capillare a cui è applicato un campo elettrico i frammenti di DNA grazie alle loro cariche negative cominciano a migrare verso il polo positivo i più corti migrano più velocemente quindi possiamo confrontare la lunghezza dei frammenti in base alla loro velocità al termine della corsa elettroforetica un laser eccita i marcatori fluorescenti legate ai nucleotidi modificati e un rivelatore registra il tipo di luce emessa. Abbiamo così tutti gli elementi per ricostruire la sequenza, a ciascuno dei quattro colori corrisponde una diversa base azotata. La sequenza così ottenuta è complementare alla sequenza che si voleva conoscere lo stesso procedimento può essere usato per ottenere la sequenza di un intero genoma per far ciò il genoma è prima frammentato e il sequenziamento eseguito sui singoli frammenti. i risultati sono elaborati da un software che trova i punti di sovrapposizione e ricostruisce la sequenza completa anche in questo caso la sequenza che si ottiene è complementare alla sequenza ricercata.
Il software consente la sovrapposizione dei vari frammenti marcati fluorescenti , allora quante volte occorrerà duplicare il DNA x poterlo sequenziare, ( milioni di volte?)
Se non hai la sequenza devi usare dei primer universali. Essi sono dei primer che si appaiano poco prima della sequenza che vogliamo, quindi sul vettore (che può essere un batterio o un virus). Se invece conosci la sequenza del frammento usi dei primer interni.
No. Questo metodo fa parte della prima generazione di sequenziamento. La seconda (next generation sequencing) e terza generazione includono metodi diversi
Ma quando il laser eccita i marcatori fluorescenti legati ai nucleotidi modificati, il tipo di luce emessa rivela solo il nucleotide a cui era collegato il marcatore fluorescente o tutta la catena nucleotidica?
riscontro lo stesso problema... se i didesossinucleotidi 'terminatori di catena' ovvero quelli marcati con un fluorocromo, vengono inseriti casualmente... e si vengono a formare tanti frammenti di tutte le misure... come si arriva dalla lettura dei nucleotidi fluorescenti, alla sequenza ricercata?
ok scherzo credo di aver capito. l'elettroforesi separa in base alla grandezza... quindi dal frammento più piccolo poi in ordine tutti quelli successivi.. e allora possiamo tranquillamente prendere in considerazione l'arrivo dei nucleotidi fluorescenti in sequenza, e avremo il nostro frammento di interesse (che è quello complementare ai nucleotidi fluorescenti ovviamente)
@@stellarusso8849una estremità la conosciamo già essendo il primer, quello che viene dopo (che noi non conosciamo) è ordinato per lunghezza del frammento quindi se il primer è ad esempio di 3 nucleotidi, il quarto nucleotide sconosciuto lo andiamo a scoprire guardando il frammento costituito da 4 nucleotidi e andiamo a vedere quale dideossiribonucleotide complementare marcato si è aggiunto per formare di fatto il frammento con 4 nucleotidi. Per identificare il quinto nucleotide guardiamo il frammento costituito da 5 nucleotidi che attraverso elettroforesi si trova più in giù diciamo rispetto al frammento da 4 essendo più grande, quindi guardiamo quale dideossiribonucleotide marcato è stato aggiunto e cosi via per tutti gli altri nucleotidi...ho capito bene?
@@Roby2799 siii grazie. Diciamo che non mi era ben chiaro che l'elettroforesi capillare separando per grandezza, ci legge segmenti con un solo nucleotide di differenza. Esame andato splendidamente per fortuna!
@@stellarusso8849il mio non voleva essere un commento di spiegazione quanto più che altro di confronto e conferma che adesso ho, quindi grazie a te :), mi fa piacere per l'esame! Io ce l'ho a settembre 🤞🏻
Come capire mezz'ora di lezione all'università in meno di 5 minuti... Grazie mille!
A noi lo hanno fatto vedere lì direttamente AHAHA
Hahaha questo video è una salvezza l'ho guardato qualche mese fa per un interrogazioni di quinto anno di liceo ed adesso mi ritrovo a riguardarlo per prepararmi al test di medicina
com’è andata bro?
Ferdinando Melis sei un’icona un genio un salvatore, un uomo che ha capito che certe cose si spiegano prima di tutto con dimostrazioni grafiche e con semplicità e non facendo i sapientoni come fanno certi professori dando per scontato miliardi di cose fondamentali . Se un giorno sarò medico sarà anche grazie a questo tuo video , anche grazie a te . Grazie grazie grazie
Maronna veramente. Mi trovo d'accordo con tutto ciò che hai scritto
@@emilio4898 anche io, la spiegazione deve essere affiancata ad esempi grafici, almeno si riesce a comprendere tutto!!
Incredibile...non avevo mai capito come funzionasse...ora ho capito tutto, hai fatto un video MERAVIGLIOSO 😀
Una spiegazione davvero molto chiara! Grazie, mi è stato molto d’aiuto per capire l’argomento :D
Di seguito quello che viene detto nel video.. ho aggiunto le temperature di denaturazione, la T necessaria per far appaiare i primers e la T necessaria per la DNA polimerasi. la punteggiatura non è delle migliori perchè ho fatto tutto di fretta e per di più con il cellulare.
Il sequenziamento del DNA permette di conoscere l'esatta sequenza di nucleotidi di una molecola di DNA. Negli anni 70 Fredericks Sanger mise a punto metodo che ha premesso di sequenziare frammenti di DNA o interi genomi. Immaginiamo di dover sequenziare solo una porzione di DNA, prima è necessario amplificarlo cioè averne molte copie, per farlo si ricorre alla PCR reazione a catena della polimerasi, a questo punto le copie amplificate devono essere denaturate i due filamenti vengono separati grazie a un aumento della temperatura a 94° C, si abbassa poi la temperatura a 55° C per fare appaiare i primers, si abbassa ulteriormente a 37° C aggiungendo la DNA polimerasi (un enzima che sintetizza un nuovo filamento di DNA a partire dal filamento stampo) per avviare la sintesi è necessario anche di un primer ovvero un oligonucleotide prodotto ad hoc per legarsi al DNA da sequenziare, e servono le unità che compongono il DNA cioè desossiribonucleotidi trifosfato (dNTPs), che trasportano le quattro basi azotate: adenina, timina, guanina e citosina. Si aggiunge infine una piccola quantità di nucleotidi modificati, la modifica riguarda lo zucchero che compone il nucleotide, rispetto ai desossiribonucleotidi manca il gruppo ossidrile in posizione 3'. La chiave del metodo di sequenziamento è proprio in questa piccola differenza. Il nucleotide modificato ha anche un'altra particolarità, è legato a un marcatore fluorescente indispensabile per poter vedere il risultato. Si usano marcatori fluorescenti di quattro colori diversi uno per ciascun tipo di base azotata. Completata la miscela si avvia la sintesi di un nuovo filamento di dna. La dna polimerasi si lega al primer e aggiunge un nucleotide alla volta sempre rispettando la regola della complementarietà delle basi, il nuovo filamento si allunga finché sono aggiunti nucleotidi normali ma quando ne è inserito uno modificato la sintesi si arresta, la mancanza del gruppo ossidrile le impedisce infatti la formazione di un legame con il nucleotide successivo e provoca il distacco della DNA polimerasi. il risultato di questa fase è la formazione di un frammento di DNA a doppio filamento che ha l’ultimo nucleotide marcato. L'interruzione della sintesi è l'elemento cruciale del metodo di Sanger e che perciò è chiamato metodo terminazione di catena. L'inserimento di un nucleotide modificato è dovuto al caso per cui anche la lunghezza del filamento sintetizzato risulta casuale ma se la sintesi avviene tante volte grazie alle copie prodotte con la PCR avremo filamenti di tutte le lunghezze possibili di poche basi o lunghi quanto l'intera porzione di DNA da sequenziare.
Nella fase successiva si denatura nuovamente il DNA i singoli filamenti vengono quindi sottoposti ad elettroforesi capillare con questa tecnica la miscela è inserita in un capillare a cui è applicato un campo elettrico i frammenti di DNA grazie alle loro cariche negative cominciano a migrare verso il polo positivo i più corti migrano più velocemente quindi possiamo confrontare la lunghezza dei frammenti in base alla loro velocità al termine della corsa elettroforetica un laser eccita i marcatori fluorescenti legate ai nucleotidi modificati e un rivelatore registra il tipo di luce emessa. Abbiamo così tutti gli elementi per ricostruire la sequenza, a ciascuno dei quattro colori corrisponde una diversa base azotata. La sequenza così ottenuta è complementare alla sequenza che si voleva conoscere lo stesso procedimento può essere usato per ottenere la sequenza di un intero genoma per far ciò il genoma è prima frammentato e il sequenziamento eseguito sui singoli frammenti. i risultati sono elaborati da un software che trova i punti di sovrapposizione e ricostruisce la sequenza completa anche in questo caso la sequenza che si ottiene è complementare alla sequenza ricercata.
grazie mille, utilissimo!
Ciao! Sapresti dirmi se anche per il sequenziamento dell'intero genoma(di cui parla alla fine), si ricorre alla PCR per i singoli frammenti? Grazie.
MERAVIGLIOSO, GRAZIE PER QUESTO VIDEO MI E' STATO DI GRANDE AIUTO !
quest'uomo è decisamente nella top 10 supereroi che possono battere thanos anche con il guanto dell'infinito
Chiarissimo!!grazie
Che bello questo video! Ce ne sarebbero altri, sempre fatti da lei, in cui parla dei metodi di NGS ?
video molto chiaro e completo!
è un video davvero chiaro e completo😃
Video molto chiaro, complimenti e grazie mille
molto chiaro e preciso, grazie mille
Grazie
video molto chiaro... finalmente ho capito l'argomento! magari ci fossero più video così
potreste fare un video come questo, che tratta il metodo shotgun?
Utilissimo per la maturità
Complimenti, molto chiaro.
Bravo Synergo
Ahahahah
La sua voce... è una favola, puoi per forza stare attento
WOW 😍😍😍😍😍😍😍😍😍
può fare anche il NEXT?
Il software consente la sovrapposizione dei vari frammenti marcati fluorescenti , allora quante volte occorrerà duplicare il DNA x poterlo sequenziare, ( milioni di volte?)
grazie da due universitarie disperate
Bravissimo, Zanichelli pessimo.
Veramente bravissimo, ho capito immediatamente una cosa che non ho capito in 3 lezioni di antropologia molecolare 😂 grazie
grazie, video preziosissimo
chiarissimo
💕💕💕
Ma come sintetizzo il primer di innesco duplicazione se non so la sequenza a cui deve appaiasi (che appunto è quella che devo trovare) ?
Se non hai la sequenza devi usare dei primer universali. Essi sono dei primer che si appaiano poco prima della sequenza che vogliamo, quindi sul vettore (che può essere un batterio o un virus). Se invece conosci la sequenza del frammento usi dei primer interni.
ti amo
grazie
Strepitoso!!!
Questo video è ✨️ ORO ✨️ grazie
Video stupefacente, chiarissimo e facile da capire
Complicato ed affascinante
Madonna finalmente ho capito
È chiarissimo, grazie mille!!
Spiegato molto bene! Anche le animazioni fantastiche!!
GG
Chiedo scusa, questo è il metodo "next generation sequencing"?
No. Questo metodo fa parte della prima generazione di sequenziamento.
La seconda (next generation sequencing) e terza generazione includono metodi diversi
Geniale!
Come si sintetizza il primer?
IO TI AMO
Grazie mille
Ma chi mi dice che il primo che arriva al rivelatore è il nucleotide n 1
Perché è il più breve, quindi quello che migra più velocemente nel gel. A seguire arrivano tutti gli altri in ordine
@@andreapagnoni grazie Andrea, adesso mi è più chiaro menomale che non me l'ha chiesto all'esame 😅
@@bestina87 Di nulla! Spero sia andato bene comunque
@@andreapagnoni più che bene! 30L dai non mi lamento 😂
Grazie milleee!
IO E LA ENZA TI AMIAMO
Scusate il gioco di lettere
Ma quando il laser eccita i marcatori fluorescenti legati ai nucleotidi modificati, il tipo di luce emessa rivela solo il nucleotide a cui era collegato il marcatore fluorescente o tutta la catena nucleotidica?
riscontro lo stesso problema... se i didesossinucleotidi 'terminatori di catena' ovvero quelli marcati con un fluorocromo, vengono inseriti casualmente... e si vengono a formare tanti frammenti di tutte le misure... come si arriva dalla lettura dei nucleotidi fluorescenti, alla sequenza ricercata?
ok scherzo credo di aver capito. l'elettroforesi separa in base alla grandezza... quindi dal frammento più piccolo poi in ordine tutti quelli successivi.. e allora possiamo tranquillamente prendere in considerazione l'arrivo dei nucleotidi fluorescenti in sequenza, e avremo il nostro frammento di interesse (che è quello complementare ai nucleotidi fluorescenti ovviamente)
@@stellarusso8849una estremità la conosciamo già essendo il primer, quello che viene dopo (che noi non conosciamo) è ordinato per lunghezza del frammento quindi se il primer è ad esempio di 3 nucleotidi, il quarto nucleotide sconosciuto lo andiamo a scoprire guardando il frammento costituito da 4 nucleotidi e andiamo a vedere quale dideossiribonucleotide complementare marcato si è aggiunto per formare di fatto il frammento con 4 nucleotidi. Per identificare il quinto nucleotide guardiamo il frammento costituito da 5 nucleotidi che attraverso elettroforesi si trova più in giù diciamo rispetto al frammento da 4 essendo più grande, quindi guardiamo quale dideossiribonucleotide marcato è stato aggiunto e cosi via per tutti gli altri nucleotidi...ho capito bene?
@@Roby2799 siii grazie. Diciamo che non mi era ben chiaro che l'elettroforesi capillare separando per grandezza, ci legge segmenti con un solo nucleotide di differenza. Esame andato splendidamente per fortuna!
@@stellarusso8849il mio non voleva essere un commento di spiegazione quanto più che altro di confronto e conferma che adesso ho, quindi grazie a te :), mi fa piacere per l'esame! Io ce l'ho a settembre 🤞🏻
Grazie mille, questo video mi ha davvero aiutata tantissimo a capire come funzionasse!!